Po absorpcii,vitamín D3musí podstúpiť metabolickú aktiváciu skôr, ako môže vykonávať svoju biologickú funkciu. V pečeni je cholekalciferol 25-hydroxylovaný na vytvorenie 25-hydroxycholecalciferolu [25-(OH)-D3], po ktorom nasleduje 1-alfa hydroxylácia v obličkách a tvorí 1,25-dihydroxycholecalciferol [ 1,25-(OH)2-D3]. Oblička je kľúčovým orgánom na produkciu aktívneho vitamínu D [1,25-(OH)2-D3].
Asi 85% ~ 88% 25OHD a 1,25 (OH) 2D v krvnom obehu sú viazané na proteín viažuci prášok vitamínu D3 (DBP), 12% ~ 15% je viazaných na albumín, asi menej ako 1% je vo voľnej forme. DBP je syntetizovaný hlavne pečeňou a je tiež produkovaný v iných tkanivách a orgánoch, ako sú obličky, semenníky a tuk. Podobne ako iné proteíny viažuce pohlavné hormóny v regulácii, perorálna antikoncepcia a tehotenstvo zvyšujú syntézu DBP. In vitro, glukokortikoidy a niektoré cytokíny, ako je epidermálny rastový faktor (EGF), interleukín-6 (IL-6), transformujúci rastový faktor β (TGF-β) atď. stimulujú DBP TGF-β inhibujú syntézu DBP.

Faktory, ktoré ovplyvňujúvitamín D3hladiny sú čokoľvek, čo narúša produkciu vitamínu D pokožkou tela, vrátane ochorenia pečene a obličiek, čo môže viesť k nedostatku vitamínu D. ako:
- Chronické ochorenie alebo zdravotné postihnutie, ktoré zabraňuje pravidelnému slnečnému žiareniu
- Žijú v oblastiach nad 37 stupňov severnej šírky alebo pod 37 stupňov južnej šírky v zime, ale to je diskutabilné
Ľudia tmavej pleti a starší dospelí produkujú menej vitamínu D
